32  方法

本文涉及到的材料和方法包含了以下内容：

从这里可以看出，它们组织和结果部分是一致的。

32.1 数据收集和整理

在生物信息学研究中，尤其是当研究基于公开数据时，详细记录数据的收集和下载过程是至关重要的。这种透明度对于确保研究的可靠性和可重复性至关重要。通过清晰地描述数据的来源、收集方法和下载步骤，我们为其他研究者提供了一个清晰的指南，使他们能够理解数据的合理性和适用性。此外，详细说明数据的获取过程也有助于建立研究的信誉，因为它允许读者评估数据的质量和相关性。这包括提供数据集的详细信息，如数据集的名称、来源链接、访问日期以及任何必要的数据集描述或特征。

Standardized RNA-Seq reads from the LIHC-US and LIRI-JP projects (Release 28) were retrieved from The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://cancergenome.nih.gov/) and the International Cancer Genome Consortium (ICGC, https://dcc.icgc.org/), respectively.

Based on the TNM staging system, HCC is classified into four stages: stage I, stage II, stage III, and stage IV.

32.2 数据整合

在分析不同来源的转录组数据时，我们面临着批次效应的挑战，这些效应可能会对生物学变异产生干扰。批次效应的存在可能会影响我们对数据的解释，因此，采取适当的方法来降低这些效应是必要的。在研究中，我们明确指出了用于减少批次效应的策略和技术，包括但不限于数据标准化、批次校正算法或多变量分析方法。我们详细描述了所采用的方法。这些信息对于其他研究者来说是至关重要的，因为它们不仅有助于理解我们如何控制批次效应，而且也为其他研究提供了可能的解决方案。通过这种方法，我们确保了研究结果的生物学解释更加准确，减少了批次效应对数据的潜在影响，从而提高了研究的质量和可信度。

A consolidated dataset incorporating the LIHC-US and LIRI-JP datasets was created using the R packages “limma” (version 3.58.11) and “SNM” (version 1.50.0).

32.3 差异基因分析

在执行差异分析的过程中，我们首先详细说明了所使用的软件工具和版本信息，确保了分析过程的透明度和标准化。此外，我们明确了用于判断基因表达差异显著性的标准，包括使用的统计测试、阈值设定以及校正多重比较的方法。

To identify differentially expressed genes (DEGs) in the merged dataset, we applied a threshold of |logFC| > 0.5 and an adjusted-pvalue < 0.05 using the “limma” (version 3.58.11) R package.

32.4 功能富集分析

功能富集分析需要做和差异分析类型的处理。

Gene Ontology (GO) enrichment analysis was carried out to explore the biological significance of the differentially expressed genes (DEGs) utilizing the clusterProfiler (version 4.10.1) R package.

32.5 免疫浸润分析

同理免疫浸润分析也是类似的道理。

The ImmuCellAI, a gene set signature-driven approach, serves as a deconvolution algorithm capable of estimating the abundance of 24 distinct immune cell types.

32.6 候选标记物识别

该部分是我们研究方法学的核心，详细描述了如何利用机器学习技术识别候选生物标记物。我们采用了三种不同的机器学习方法，并明确了每种方法所涉及的软件工具、分析步骤以及用于评估模型性能的判断标准。

In conclusion, we consolidated the overlapping genes identified by the LASSO-LR, SVM-RFE, and Brouta-RF algorithms for further analysis.

32.7 诊断ROC曲线

在诊断生物标记物的研究中，接收者操作特征（ROC）曲线扮演着至关重要的角色。ROC曲线的绘制和分析对于判断标记物的诊断效能至关重要。为了确保评估过程的透明度和结果的可重复性，我们明确指出了用于生成ROC曲线的软件工具及其版本。

The effectiveness of each diagnostic biomarker was evaluated using receiver operating characteristic (ROC) curves generated by the “pROC” (version 1.18.5) and “multipleROC” (version 0.1.1) R packages.

32.8 单细胞分析

在进行单细胞分析的过程中，我们特别强调了所使用的软件工具及其版本的重要性。详细记录了软件的配置参数和分析流程，包括数据预处理、质量控制、细胞类型鉴定、基因表达模式的聚类分析以及差异表达基因的识别。这些步骤的详细描述不仅有助于其他研究者理解我们的分析方法，而且也便于他们在自己的研究中应用相似的分析策略。

The GSE149614 raw data was retrieved from GEO databases.

32.9 统计方法

统计方法是文章必不可少的部分，明确软件的版本等信息。

Statistical analysis was performed using R (version 4.3.3) and RStudio (version 2023.12.1+402).